Desain Primer Universal Berbasis Gen Mitokondria untuk Identifikasi Spesies Hewan dengan Pendekatan K-mer In Silico (Studi Kasus: Sekuens Gen Mitokondria COI, cyt b, dan 16S rRNA)

Abstract

Autentikasi produk pangan untuk menjamin kehalalan sangat bergantung pada ketepatan dalam mengidentifikasi spesies hewan. Salah satu metode yang umum digunakan adalah PCR, yang membutuhkan desain primer universal yang tepat. Proses identifikasi daerah konservatif antar spesies justru sering mengalami kendala karena keterbatasan metode konvensional dalam mengolah data sekuens biologis dalam jumlah besar secara otomatis. Oleh karena itu, penelitian ini menggunakan pendekatan bioinformatika secara in silico untuk menganalisis sekuens mtDNA (16S rRNA, cyt b, dan COI). Analisis dilakukan melalui pendekatan alignment-free berbasis k-mer dengan rentang nilai k = 3 hingga 15 untuk mengidentifikasi motif konservatif (ambang kemunculan ≥40% dari 30 sekuens). Selanjutnya, kandidat primer yang diperoleh dari motif konservatif dievaluasi berdasarkan karakteristik fisik (panjang, GC Content, suhu leleh/Tm) serta uji universalitas menggunakan pendekatan in silico. Berdasarkan evaluasi parameter in silico, nilai k optimal yang diperoleh adalah k = 13 untuk gen 16S rRNA, k = 8 untuk gen cyt b, dan k = 10 untuk gen COI. Hasil validasi universalitas menunjukkan bahwa seluruh kandidat primer hasil desain sendiri pada ketiga gen gagal mengamplifikasi spesies target (universalitas 0%). Meskipun demikian, primer standar pada gen 16S rRNA berhasil mencapai universalitas sempurna (100%) dan berpotensi untuk mendeteksi berbagai spesies hewan secara luas. Gen cyt b menunjukkan potensi terbatas dengan universalitas primer standar hanya 16,7%, sedangkan gen COI menunjukkan performa paling rendah karena tingkat konservasi motifnya paling rendah. Secara keseluruhan, bahwa variasi genetik antar spesies masih cukup tinggi pada daerah target primer, sehingga menjadi tantangan dalam perancangan primer universal.